Aracely A. Lutes , 1, 2 William B. Neaves , 1, 3 Diana P. Baumann , Winfried Wiegräbe , 1 dan Peter Baumann 1, 2, 4, *

Sumber Tulisan : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

Meskipun reproduksi biseksual telah terbukti sangat berhasil, populasi betina partenogenetik sering terjadi pada taksa tertentu termasuk kadal cambuk dari genus Aspidoscelis . Analisis allozim mengungkapkan tingkat heterozigositas tetap yang tinggi pada spesies partenogenetik 1 , 2 inimendukung pandangan bahwa mereka berasal dari peristiwa hibridisasi antara spesies seksual terkait. Masih belum jelas bagaimana proses meiotik diubah untuk menghasilkan telur diploid sambil mempertahankan heterozigositas. Di sini kami menunjukkan bahwa meiosis dimulai dengan jumlah kromosom dua kali lipat dalam spesies partenogenetik versus seksual, suatu mekanisme yang memberikan dasar untuk menghasilkan gamet dengan kandungan kromosom yang tidak tereduksi tanpa penyimpangan mendasar dari program meiotik klasik. Pengamatan kami terhadap kompleks sinaptonemal dan chiasmata menunjukkan bahwa program meiosis khas terjadi dan heterozigositas tidak dipertahankan dengan melewati rekombinasi. Sebagai gantinya, fluorescent in situprobe hibridisasi yang membedakan antara homolog mengungkapkan bahwa bivalen terbentuk antara kromosom saudara, produk yang identik secara genetik dari yang pertama dari dua siklus replikasi premeiotik. Pasangan kromosom saudara menyediakan mekanisme untuk pemeliharaan heterozigositas, yang sangat penting untuk mengimbangi penurunan kebugaran yang terkait dengan kurangnya keragaman genetik pada spesies partenogenetik.

Partenogenesis sejati, ditandai dengan tidak adanya kontribusi laki-laki, telah dideskripsikan untuk berbagai spesies reptil termasuk kadal cambuk, tokek, ular buta, dan kadal batu 3 . Kadal Whiptail dari genus Aspidoscelis , yang sebelumnya merupakan bagian dari genus Cnemidophorus 4 , sebagian besar berasal dari Amerika Serikat Barat Daya dan Meksiko, dan sekitar sepertiga dari lebih dari 50 spesies bereproduksi dengan partenogenesis yang diwajibkan.

Studi morfologis, kariotipik dan biokimia memberikan bukti kuat untuk asal hibrida dari semua spesies partenogenetik Aspidoscelis yang diperiksa 1 , 5 , 6 . Sementara hibridisasi antara individu-individu dari spesies yang berbeda dapat menjelaskan tingkat heterozigositas yang awalnya tinggi di seluruh genom, analisis alozim menunjukkan kegigihan heterozigositas yang mengejutkan selama beberapa generasi dalam beberapa garis keturunan partenogenetik dari Aspidoscelis , termasuk A. tesselata dan A. neomexicana 6 . Penerimaan cangkok kulit antara individu dari spesies partenogenetik 7 – 10 dan studi biokimia pada beberapa garis keturunan yang dipelihara di laboratorium6 lebih lanjut mendukung keseragaman genetik.

Mekanisme yang mendasari reproduksi klon dan heterozigositas tetap telah menjadi topik banyak spekulasi. Sebagian besar variasi dari program meiotik yang akan menghasilkan oosit diploid dengan melewatkan divisi atau dengan fusi oosit haploid dengan badan kutub tidak dapat menjelaskan heterozigositas tetap kecuali jika rekombinasi antar homolog ditekan. Berdasarkan pengecualian model-model alternatif dan pengamatan sejumlah besar kromosom dalam dua oosit dari A. uniparens 11 , endoreplikasi kromosom diusulkan sebagai mekanisme yang paling mungkin untuk menghasilkan oosit matang yang membawa komplemen lengkap kromosom somatik dan mempertahankan heterozigositas. 12. Untuk menguji hipotesis ini, kami mulai mengukur kandungan DNA dalam oosit spesies partenogenetik diploid A. tesselata dan kontrol reproduksi seksual A. gularis . Extant A. gularis dan A. tigris terkait erat dengan individu yang hibridisasi untuk menghasilkan spesimen pendiri A. tesselata 1 , 2 , 13 , 14 .

Kami mengisolasi germinal vesicles (GVs), inti oocyte, dan memvisualisasikan kromosom yang diwarnai 4 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dengan mikroskop dua-foton. Bivalen mudah diamati pada GV dari A. gularis dan A. tesselata , dan morfologi mereka konsisten dengan tahap diplotene dari profase I ( Gambar 1a, b ). Inspeksi visual rekonstruksi tiga dimensi tujuh gularis dan lima tesselata GV mengungkapkan jumlah bivalen yang lebih besar dalam tesselata GV dibandingkan dengan gularis. Ambiguitas dalam mengidentifikasi batas-batas kromosom individu mencegah penghitungan bivalen yang akurat pada tahap ini. Sebagai gantinya, kami mengukur volume yang ditempati oleh kromosom di setiap GV sebagai ukuran tidak langsung dari konten DNA ( Gbr. 1c ; Sup. Tabel 1 ). Tidak seperti pengukuran intensitas fluoresensi, pendekatan ini kuat terhadap perubahan efisiensi pewarnaan atau fluktuasi intensitas laser. Kromosom A. tesselata menempati 2,24 +/- 0,18 kali lipat volume rata-rata sampel A. gularis . Sementara indikasi peningkatan dua kali lipat dalam konten DNA dari oase profase dalam spesies partenogenetik, perbedaan dalam ukuran genom juga bisa menjelaskan peningkatan volume kromosom.

Gambar 1
Oosit dari parthenogenetic A. tesselata mengandung dua kali jumlah DNA kromosom dibandingkan dengan A. gularis seksual.  (a) Kromosom yang diwarnai DAPI dalam germinal vesicles (GVs) dari A. gularis .  Proyeksi 3D dari empat GV ditampilkan, detail ukuran dan kuantifikasi tersedia sebagai Suppl. Tabel 1 . Skala bar sesuai dengan 10 ?m. (B) GV dari A. tesselata . (c) Kuantifikasi volume kromosom. (D) Kuantifikasi konten DNA dalam sel somatik oleh flow cytometry. Intensitas fluoresensi dari rangkap tiga biologis ?50.000 sel rata-rata dan dinormalisasi terhadap sampel dari A. gularis yang ditetapkan pada 100 untuk memfasilitasi perbandingan.

Meskipun sel somatik dari A. gularis dan A. tesselata keduanya mengandung 46 kromosom 15 , perbandingan langsung ukuran genom diperlukan untuk menginformasikan analisis kami. Mengambil keuntungan dari fakta bahwa eritrosit reptil berinti, kami melakukan sampel darah untuk mengalirkan analisis sitometri dan menemukan bahwa kandungan DNA nuklir dalam sel somatik berbeda kurang dari 1% antara kedua spesies ( Gbr. 1d ). Sebagai perbandingan, sampel dari diploid seksual A. tigris dan triploid partenogenetik A. exsanguis * juga dianalisis, dengan yang terakhir menunjukkan peningkatan sekitar 50% dalam konten DNA seperti yang diharapkan ( Gbr. 1d). Konfirmasi independen untuk penggandaan jumlah kromosom diperoleh dengan memeriksa GV pada profase lanjut. Pada tahap ini kromosom sangat padat dan konsisten dengan penggandaan jumlah kromosom, dan kami dapat membedakan 46 bivalen pada A. tesselata GV ( Suppl. Fig. 1 ).

Memasuki meiosis dengan komplemen kromosom 8n akan memungkinkan hewan partenogenetik memanfaatkan dua divisi meiosis normal untuk menghasilkan gamet diploid. Namun, pemeliharaan jangka panjang dari heterozigositas di seluruh genom hanya dipastikan jika cross-overs antara homolog ditekan. Pencitraan dua-foton dari kromosom diplotene dari A. tesselata dan spesies partenogenetik lainnya, A. neomexicana , mengungkapkan tidak ada perbedaan dibandingkan dengan kontrol seksual selain peningkatan konten DNA. Khususnya, bivalen tampaknya dihubungkan oleh chiasmata di semua sampel, menunjukkan bahwa persimpangan tidak ditinggalkan ( Gbr. 2a, b ).

Gambar 2
Visualisasi kompleks chiasmata dan synaptonemal pada parthenogenetic 
A. tesselata dan seksual A. tigris . Proyeksi bivalen dari A. tigris (a) dan A. tesselata (b) GV di diplotene. Skala bar sesuai dengan 10 ?m. (c) EM gambar A. tesselata GV di pachytene. 
Beberapa bagian kompleks sinaptonem terlihat. Skala bar sesuai dengan 2 ?m. 
Tampilan dekat untuk dua area ditunjukkan dalam (d) dan (e) . Tampilan close-up SC dari 
A. tigris ditunjukkan pada (f) . Skala bar sesuai dengan 200 nm.

Untuk memeriksa lebih lanjut pasangan kromosom, bagian tipis ovarium dari A. tesselata, A. tigris , dan A. neomexicana diperiksa dengan mikroskop elektron. Kompleks synaptonemal (SCs), dicirikan oleh elemen lateral dan sentral yang terdefinisi dengan baik, diamati pada semua spesies yang diperiksa memberikan dukungan lebih lanjut bahwa program meiotik khas sedang berlangsung ( Gambar 2c ke f , Suppl. Gambar. 2 ). Berdasarkan keberadaan SCs dalam pachytene dan chiasmata di diplotene, kami menduga bahwa pemasangan dan rekombinasi kromosom meiosis tidak dilewati pada spesies Aspidoscelis partenogenetik .

Penggandaan kromosom premeiotik memungkinkan pembentukan bivalen terjadi antara homolog seperti pada meiosis normal atau antara kromosom saudara ( Gbr. 3 ). Untuk membedakan antara kemungkinan-kemungkinan ini, kami berusaha mengidentifikasi probe yang secara selektif mengenali satu kromosom tertentu dalam sepasang homolog. Kami menemukan bahwa 26 dari 46 kromosom A. tigris , termasuk semua 22 makrokromosom dan 4 mikrochromosom, mengandung jejak besar pengulangan telomer internal di samping sinyal pada ujung kromosom ( Gambar 4a ). Sebaliknya, pewarnaan metafase kromosom A. inornata dengan probe asam protein-nukleat telomerik hanya menunjukkan sinyal pada termini kromosom ( Gbr. 4b). Konsisten dengan asal hibrida dari dua spesies seksual ini 1 , 2 , 5 , A. kromosom neomexicana mengandung pengulangan internal yang besar pada 13 kromosom, memungkinkan kita untuk secara jelas mengidentifikasi 13 kromosom yang diwarisi dari A. tigris dalam hibrida F1 asli ( Gbr. 4c ) . Dalam konteks bivalen, sinyal hibridisasi di kedua sisi menunjukkan pairing kromosom saudara, sedangkan hibridisasi di hanya satu sisi mendukung pasangan homolog.

Gambar 3
Meiosis pada spesies Aspidoscelis seksual dan partenogenetik . Pada meiosis normal, satu putaran replikasi DNA diikuti oleh dua divisi berturut-turut yang menghasilkan gamet haploid dan tiga badan kutub. Homolog ditampilkan dalam warna merah dan biru. 
Rekombinasi menghasilkan kromosom kimaerik. Penggandaan kromosom premeiotik memungkinkan untuk memasangkan kromosom homolog atau saudara. Pemasangan dan rekombinasi homolog menyebabkan hilangnya heterozigositas pada oosit dewasa. 
Rekombinasi antara pasangan kromosom saudara mempertahankan heterozigositas di semua lokus.
Gambar 4
Pengulangan telomer internal membedakan homolog dalam A. neomexicana dan menunjukkan pasangan kromosom saudara. ( A ) A CCCTAA (3) penyelidikan asam nukleat peptida (merah) mengidentifikasi kromosom termini dan daerah pengulangan telomer internal yang besar pada penyebaran metafase kromosom A. tigris yang dibuat dari kultur fibroblast. Kromosom yang diwarnai DAPI ditunjukkan dengan warna biru. (B) sinyal terminal kromosom, tetapi tidak ada pengulangan telomeric nternal terdeteksi dalam 
A. inornata . (c) Kromosom yang diwarisi dari A. tigris tetapi tidak dari A. nornata diidentifikasi oleh pengulangan telomer internal di A. neomexicana .
(D) Proyeksi subset gambar dari A. neomexicana GV divisualisasikan dengan mikroskop confocal. Kromosom yang diwarnai DAPI berwarna putih dan probe telomerik berwarna merah. (e) Tampilan dekat dari empat area representatif yang menunjukkan sinyal fluoresensi berpasangan. Perbedaan dalam resolusi berasal dari perbedaan sudut proyeksi.

Untuk melestarikan pengaturan tiga dimensi kromosom dalam GV dan untuk memberikan resolusi spasial yang lebih baik daripada yang biasa diperoleh dalam penyebaran kromosom, kami mengadaptasi prosedur FISH untuk melakukan hibridisasi pada GV utuh. Di setiap situs di mana hibridisasi internal kromosom terdeteksi, sinyal diamati pada kedua sisi bivalen ( Gbr. 4d, e). Penting untuk dicatat bahwa kromatid saudara perempuan yang dihasilkan dari putaran replikasi terbaru muncul sebagai satu secara sitologis, karena mereka terkait erat satu sama lain sepanjang mereka selama tahap meiosis ini. Kehadiran eksklusif sinyal hibridisasi berpasangan karena itu sangat menunjukkan bahwa bivalen terdiri dari kromosom saudara, bukan homolog. Berdasarkan percobaan ini, kami menyimpulkan bahwa untuk 13 kromosom yang mana penyelidikan hibridisasi telomerik membedakan saudara dan homolog dalam A. neomexicana , pasangan kromosom saudara adalah aturannya.

Penapisan beberapa probe berulang tri-, tetra-, dan heksanukleotida diidentifikasi (CCAAGG) n sebagai penanda tambahan untuk setidaknya sembilan kromosom dalam A. neomexicana yang berasal dari A. tigris ( Sup. Gambar 3a hingga c ). Ketika hibridisasi ke kromosom diploten dalam GV yang tertanam akrilamida, hanya sinyal berpasangan yang diamati ( Sup. Gambar. 3d dan e ). Singkatnya, dua penyelidikan independen memungkinkan kita untuk membedakan kromosom saudara dari homolog, dan untuk lebih dari 20 bivalen yang diperiksa, pasangan terjadi secara eksklusif di antara kromosom saudara.

Memasuki meiosis dengan dua kali jumlah kromosom yang biasa memungkinkan spesies partenogenetik untuk menghasilkan oosit yang membawa komplemen kromosom somatik lengkap sambil mempertahankan program meiotik yang sudah mapan. Ada dua jalur utama di mana oosit premeiotik spesies diploid dapat memperoleh delapan daripada empat set kromosom. Salah satunya adalah proses di mana duplikasi kromosom terjadi tanpa sitokinesis; ini disebut endomitosis atau endoreplikasi 16 . Atau, sel kuman 8n dapat timbul melalui penggabungan dua sel baik sebelum atau setelah penggandaan kromosom premeiotik akhir. Ada banyak preseden untuk kedua mode amplifikasi genom pada tumbuhan dan hewan, tetapi mekanisme pengaturannya sebagian besar tidak jelas.

Pada spesies seksual, kromosom homolog membentuk bivalen, dan rekombinasi meiotik meningkatkan keragaman genetik sambil memastikan pemisahan kromosom yang teratur selama pembelahan meiosis pertama. Mekanisme yang sama akan mengakibatkan hilangnya heterozigositas pada spesies partenogenetik, sedangkan pembentukan bivalen dari kromosom saudara identik secara genetik mempertahankan heterozigositas. Yang menarik, variasi yang sama dari program meiotik ini tampaknya memungkinkan reproduksi partenogenetik pada spesies yang sangat berbeda. Penggandaan kromosom premeiotik telah didokumentasikan dalam salamander ambystomatid triploid 17 serta belalang partenogenetik ( Warramaba virgo ) 18. Dalam kedua kasus, pasangan kromosom saudara disarankan berdasarkan morfologi bivalen. Meskipun kurangnya penanda molekuler dalam penelitian ini menghalangi kesimpulan definitif, persamaan yang mencolok dengan kadal whiptail sangat menunjukkan bahwa mekanisme umum memungkinkan reproduksi partenogenetik pada berbagai kelompok hewan. Tampaknya penyimpangan yang relatif sederhana dari program oogenesis yang mapan sudah cukup untuk memungkinkan partenogenesis. Namun, hilangnya heterozigositas, pewarisan paternal dari sentrosom, dan persyaratan untuk pembuahan dalam memicu penyelesaian meiosis wanita tampaknya merupakan hambatan yang tidak berhubungan dengan reproduksi partenogenetik.

Metode

Koloni laboratorium dari spesies Aspidoscelis berasal dari hewan yang dikumpulkan di Texas dan New Mexico di bawah izin dari Departemen Permainan dan Ikan New Mexico (izin # 3199 dan 3395).

Isolasi dan kuantifikasi GV volume kromosom

Ovarium dari kadal dewasa dan sub-dewasa diisolasi, diwarnai dengan 4 ?, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dan dicitrakan menggunakan sistem Zeiss LSM 510 dalam mode eksitasi dua-foton. Metode pemilihan ambang batas otomatis nonparametrik dan tanpa pengawasan yang dikembangkan oleh Otsu digunakan untuk memperoleh pengukuran volume kromosom yang tidak bias.

Hibridisasi in- fluorescent in situ (IKAN)

Fibroblas embrionik yang diobati dengan colcemid dipanen, difiksasi dan digunakan untuk menyiapkan penyebaran metafase. IKAN dilakukan pada penutup yang kering menggunakan AlexaFluor-berlabel peptide-nucleic acid (PNA) dan probe terkunci-nucleic acid (LNA). Sampel dicitrakan pada mikroskop fluoresensi dan gambar dianalisis dengan perangkat lunak AxioVision. IKAN pada kromosom meiotik dilakukan setelah menanamkan GV dalam gel akrilamida.

Mikroskop elektron transmisi

Bagian ultrathin dari ovarium tertanam epoksi dikumpulkan pada jaringan tembaga, diwarnai dengan 2% uranil asetat dalam 50% metanol selama 10 menit, diikuti oleh 1% timbal sitrat selama 7 menit. Bagian difoto menggunakan mikroskop elektron transmisi FEI pada 80 kV.

Referensi

1. Neaves WB. Adenosine deaminase fenotip di antara kadal seksual dan partenogenetik dalam gen Cnemidophorus (Teiidae) J Exp Zool. 1969; 171 : 175–183. [ PubMed ] [ Google Cendekia ]

2. Neaves WB, Gerald PS. Isozim dehidrogenase laktat dalam kadal teiid partenogenetik (Cnemidophorus) . 1968; 160 : 1004-1005. [ PubMed ] [ Google Cendekia ]

3. Vrijenhoek RC, Dawley RM, Cole CJ, Bogart JP. Dalam: Evolusi dan Ekologi Vertebrata Unisexual. Dawley RM, Bogart JP, editor. Vol. 466. Museum Negara Bagian New York; New York: 1989. hlm. 19–23. [ Google Cendekia ]

4. Reeder TW, Cole CJ, Dessauer HC. Hubungan filogenetik Kadal Whiptail dari Genus Cnemidophorus (Squamata: Teiidae): Sebuah Tes Monophyly, Evaluasi Evolusi Karyotypic, dan Review Origins Hibrid. Amer Mus Novitates. 2002; 3365 : 1–61. [ Google Cendekia ]

5. Lowe CH, Wright JW. Evolusi Spesies Partenogenetik Cnemidophorus (Kadal Whiptail) di Amerika Utara Barat. Jurnal Akademi Sains Arizona. 1966; 4 : 81–87. [ Google Cendekia ]

6. Dessauer HC, Cole CJ. Warisan klonal dalam kadal cambuk partenogenetik: bukti biokimia. J Hered. 1986; 77 : 8-12. [ Google Cendekia ]

7. Cordes JE, Walker JM. Histokompatibilitas kulit antara kelas pola syntopic C dan D partenogenetik Cnemidophorus tesselatus di New Mexico. J Herpetol. 2003; 37 : 185–188. [ Google Cendekia ]

8. Cordes JE, Walker JM. Implikasi evolusioner dan sistematis histokompatibilitas kulit di antara kadal daun teh partenogenetik: Tiga kelas pola warna Aspidoscelis dixoni dan satu dari Aspidoscelis tesselata. Copeia. 2006: 14–26. [ Google Cendekia ]

9. Maslin TP. Pencangkokan kulit pada kutu daun teh biseksual Cnemidophorus sexlineatus dan pada C. tesselatus J Exp Zool yang uniseksual . 1967; 166 : 137–149. [ PubMed ] [ Google Cendekia ]

10. Cuellar O, Smart C. Analisis histo-kompatibilitas pada populasi alami kadal cambuk biseksual Cnemidophorus tigris. Transplantasi. 1977; 24 : 127–133. [ PubMed ] [ Google Cendekia ]

11. Cuellar O. Reproduksi dan mekanisme restorasi meiotik pada kadal partenogenetik Cnemidophorus uniparens. J Morphol. 1971; 133 : 139–165. [ PubMed ] [ Google Cendekia ]

12. Neaves WB. Tetraploidy dalam Kadal Hibrida Genus Cnemidophorus (Teiidae) Brev Mus dari Comp Zool. 1971; 381 : 1–25. [ Google Cendekia ]

13. Dessauer HC, Cole CJ. Dalam: Evolusi dan ekologi vertebrata berkelamin tunggal. Dawley RM, Bogard JP, editor. Vol. 466. NY: Buletin Museum Negara; 1989. hlm. 49–71. [ Google Cendekia ]

14. Parker ED, Jr, Selander RK. Organisasi keanekaragaman genetik dalam kadal partenogenetik Cnemidophorus tesselatus. Genetika. 1976; 84 : 791–805. [ Artikel gratis PMC ] [ PubMed ] [ Google Cendekia ]

15. Wright JW, Lowe CH. Evolusi parthenospecies alloploid Cnemidophorus tesselatus (Say) Mamm Chromo Newslett. 1967: 95–96. [ Google Cendekia ]

16. Edgar BA, Orr-Weaver TL. Siklus sel endoreplikasi: lebih banyak dengan lebih sedikit. Sel. 2001; 105 : 297–306. [ PubMed ] [ Google Cendekia ]

17. Macgregor HC, Uzzell TM., Jr Gynogenesis dalam salamander yang berhubungan dengan Ambystoma jeffersonianum Science. 1964; 143 : 1043–1045. [ PubMed ] [ Google Cendekia ]

18. MJD Putih, Cheney J, KHL Kunci. Spesies partenogenetik dari belalang dengan heterozigositas struktural yang kompleks (Orthoptera: Acridoidea ) Aust J Zool. 1963; 11 : 1–19. [ Google Cendekia ]

Comments

Comments are closed.